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Tipo do documento: Tese
Título: Comparação do efeito do laser em baixa intensidade (660 e 780 nm) sobre a polarização de macrófagos e a modulação da expressão e síntese de citosinas envolvidas no reparo muscular
Título(s) alternativo(s): Comparison of low intensity (660 and 780 nm) laser effects on the polarization and macrophages on the modulation of expression and synthesis of cytosine involved in muscle repair
Autor: Souza, Nadhia Helena Costa 
Primeiro orientador: Fernandes, Kristianne Porta Santos
Primeiro membro da banca: Fernandes, Kristianne Porta Santos
Segundo membro da banca: Ferrari, Raquel Agnelli Mesquita
Terceiro membro da banca: Bussadori, Sandra Kalil
Quarto membro da banca: Bossini, Paulo Sergio
Quinto membro da banca: Navarro, Ricardo Scarparo
Resumo: As interações entre o músculo e os macrófagos que o invadem após a ocorrência da lesão são determinantes para a evolução do reparo deste tecido. Neste sentido, o laser em baixa intensidade (LBI) tem sido muito utilizado no tratamento destas lesões no âmbito clínico e experimental, mas pouco se conhece a respeito dos seus efeitos sobre os macrófagos e seus produtos. O objetivo principal deste estudo foi comparar os efeitos do LBI vermelho e infravermelho sobre o papel dos macrófagos no reparo muscular. Inicialmente foi realizada uma avaliação dose-resposta do efeito da irradiação com os dois comprimentos de onda (em 6 combinações de parâmetros dosimétricos) sobre a expressão gênica e proteica de IL-6, TNF-α, IL-1β por macrófagos de perfil M1(pró-inflamatório). Após a escolha das duas combinações de parâmetros que melhor modularam a expressão das três citocinas, foi realizada a avaliação do efeito de sobrenadantes de macrófagos de perfil M1 irradiados com estas duas combinações de parâmetros sobre a diferenciação de células precursoras miogênicas. Para tanto, culturas da linhagem de macrófagos J774 foram ativadas para o fenótipo inflamatório M1 e irradiadas em 2 comprimentos de onda (660nm e 780nm) com 3 combinações de parâmetros diferentes (20mW; 5J/cm2; 0,2J; 40 mW; 10J/cm2; 0,4J; ou 70 mW; 17,5J/cm2; 1J). Foi realizada a análise da expressão das citocinas IL-6, TNF-α, IL-1β por meio de qRT-PCR. O sobrenadante das culturas foi utilizado (24h após irradiações) para avaliar a produção proteica das três citocinas (ELISA) e para tratar células precursoras miogênicas (C2C12) com intuito de analisar sua diferenciação pela imunomarcação de miogenina. macrófagos não irradiadas serviram como controle. Foram realizados três experimentos independentes, em cada metodologia citada. Nos experimentos in vivo foi avaliado o perfil fenotípico dos macrófagos presentes em lesões musculares agudas tratadas com os dois comprimentos de onda, bem como a evolução do reparo tecidual nas duas situações. Para a análise in vivo, foram utilizados ratos Wistar, divididos em 04 grupos: controle (n=5); lesão muscular sem tratamento (n=15); lesão muscular tratada com LBI vermelho (n=15) e lesão muscular tratada com LBI infravermelho (n=15). Após 2, 4, e 7 dias, os animais foram sacrificados e o músculo tibial anterior foi retirado e processado para análise por imuno-histoquímica. Nos experimentos in vivo foi avaliado o perfil fenotípico dos macrófagos presentes em lesões musculares agudas tratadas com os dois comprimentos de onda, bem como a evolução do reparo tecidual nas duas situações.Os dados de imuno-expressão dos macrófagos totais (CD68+), perfil M2 (CD206+ e CD163+) foram correlacionados com as diferentes etapas do processo de reparo do músculo esquelético. Foi realizada análise morfológica qualitativa e quantitativa das células inflamatórias totais, mionecrose, vasos sanguíneos e fibras musculares imaturas. Todos os resultados foram submetidos à análise estatística. Os resultados in vitro demonstraram que o LBI infravermelho foi mais eficiente que o LBI vermelho em diminuir a expressão gênica e produção protéica de IL-6 e TNF-α por macrófagos de fenótipo M1 irradiados com estes lasers e que a irradiação com LBI de 660nm reduziu a expressão de miogenina em mioblastos tratados com sobrenadantes destes macrófagos. Os resultados in vivo demonstraram, quando da comparação com o grupo não tratado, que em 2 dias, as irradiações com LBI vermelho e com o infravermelho foram capazes de reduzir a mionecrose, o número de células inflamatórias e o número de macrófagos CD68+ e ainda de aumentar a angiogênese. Neste período somente a irradiação com laser de 780nm gerou aumento no número de macrófagos de perfil M2 (CD206+ e CD163+). Em 4 dias, somente a irradiação com o LBI de 780nm foi capaz de reduzir a mionecrose, as células inflamatórias e ainda aumentar a angiogênese, mas ambos os LBI reduziram o número de células CD68+. Em 7 dias, ambos os LBI diminuíram as células inflamatórias, aumentaram a angiogênese e o número de células CD163+. Neste período, somente o LBI de 780nm aumentou o numero de fibras imaturas e de células CD206+. A somatória dos resultados das avaliações in vitro e in vivo, permite concluir que a irradiação com laser infravermelho pode gerar efeitos superiores ao laser vermelho no tratamento de lesões musculares agudas e provavelmente esta modulação pode estar ligada sua maior capacidade de modular a ativação e a polarização de macrófagos.
Abstract: The interactions between the muscle and the macrophages which invade afteran injury occurs are crucial to the evolution of this tissue repair. In this sense, low intensity laser therapy (LLLT) has been widely used in the treatment of these lesions at the clinical and experimental level, but little is known about its effects on macrophages and their products. The aim of this study was to compare the effects of red and infrared LLLT on the role of macrophages in muscle repair. Initially an evaluation of the dose-response effect of irradiation with the two wavelengths (in 6 combinations of dosimetric parameters) on the gene and protein expression of IL-6, TNF-α, IL-1β by macrophages with an M1 (pro-inflammatory) profile was done. After choosing the two parameter combinations that best modulated the expression of the three cytokines,an evaluation of the effect of macrophage supernatants with an M1 profile, irradiated with these two parameter combinations,on the differentiation of myogenic precursor cells was done. Cultures of the macrophage lineage J774 were therefore activated by the inflammatory phenotype M1 and irradiated by two wavelengths (660nm and 780nm) with 3 different parameter combinations (20mW; 5J/cm2; 0,2J; 40 mW; 10J/cm2; 0,4J; or 70 mW; 17,5J/cm2; 1J). An analysis of the expression of the cytokines IL-6, TNF-α, IL-1β by means of qRT-PCR was performed. The culture supernatant was used (24 hours after irradiation) to assess the protein production of the three cytokines (ELISA) and for treating myogenic precursor cells (C2C12) in order to analyze their differentiation via myogenin immunoblot. Non-irradiated macrophages served as controls. Three independent experiments were performed, each using the afore mentioned methodology. In vivo experiments evaluated the phenotypic profile of macrophages present in the acute muscle injuries treated with the two wavelengths,as well as the development of tissue repair in both situations. For the analysis in vivo, Wistar rats were divided into 04 groups: control (n = 5); muscle injury without treatment (n = 15); muscle injury treated with red LLLT (n = 15) and muscle injury treated with infrared LLLT(n = 15). After 2, 4, and 7 days, animals were sacrificed and the tibialis anterior muscle was removed and processed for analysis using immunohistochemistry. In the in vivo experiments, the phenotypic profile of macrophages present in the acute muscle injuries treated with the two wavelengths, as well as tissue repair development in both situations,was evaluated. Immunohistochemical expression of total macrophages (CD68+), M2 profile (CD206+ and CD163+), was correlated with the different phases of the skeletal muscle repair process. Qualitative and quantitative morphological analyses of total inflammatory cells, myonecrosis, immature blood vessels and muscle fibers were done. All results were statistically analyzed. The in vitro results showed that the infrared LLLT was more efficient than the red LLLT in decreasing gene expression and protein production of IL-6 and TNF-α by M1 phenotype macrophages irradiated with these lasers; irradiation with 660nm LLLT reduced the myogenin expression in myoblasts treated with these macrophage supernatants. The in vivo results also showed that, when compared to the untreated group, within 2 days, red and infrared LLLT irradiation were able to reduce myonecrosis, the number of inflammatory cells and the number of CD68+ macrophages and also increase angiogenesis.During this period only irradiation with 780nm laser generated an increase in the number of macrophages with a M2 profile (CD206+ and CD163+). In 4 days, only the irradiation with the 780nm LLLT was able to reduce myonecrosis, inflammatory cells, and further enhance angiogenesis, but both LLLTs reduced the number of CD68+ cells. In 7 days, both LLLTs decreased inflammatory cells and increased angiogenesis and the number of CD163+ cells. In this period, only the 780nm LLLT increased the number of immature fibers and CD206+ cells. The sum of the results of the evaluations in vitro and in vivo, shows that irradiation with infrared laser can generate superior effects to those of the red laser when treating acute muscle injuries; this modulation may be linked to its greater ability to modulate the activation and polarization of macrophages.
Palavras-chave: macrófagos
citocinas
inflamação
terapia a laser de baixa potencia
macrophages
cytokines
inflammation
low level laser therapy
Área(s) do CNPq: CIENCIAS DA SAUDE
Idioma: por
País: Brasil
Instituição: Universidade Nove de Julho
Sigla da instituição: UNINOVE
Departamento: Saúde
Programa: Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação
Citação: Souza, Nadhia Helena Costa. Comparação do efeito do laser em baixa intensidade (660 e 780 nm) sobre a polarização de macrófagos e a modulação da expressão e síntese de citosinas envolvidas no reparo muscular. 2016. 89 f. Tese( Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação) - Universidade Nove de Julho, São Paulo.
Tipo de acesso: Acesso Restrito
URI: http://bibliotecatede.uninove.br/handle/tede/1829
Data de defesa: 3-Aug-2016
Appears in Collections:Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação

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